Vedoucí stáže: Mgr. Stanislav Pepeliaev, PhD.
Zadání projektu: Vnášení cizorodé DNA do bakteriální buňky se zpravidla začíná enzymatickým vyštěpením genu zájmu a jeho následným vložením do vektoru, nejčastěji do plazmidu. Pro štěpení DNA se využívají enzymy restriktázy, pro následné spojení fragmentů pak ligázy, nejčastěji T4 DNA ligáza. Během procesu spojeni DNA fragmentu s plazmidem dochází ke vzniku směsi produktů, ve které jen malá část představuje vektor se správně orientovaným a vloženým fragmentem. Pro selekci transformantů se používají rozmanité genetické markery, obvykle geny rezistence k antibiotikům. Avšak přítomnost rezistence ještě neznamená, že ligace proběhla úspěšně, protože mohlo dojít k ligaci prázdného vektoru. Pro zjednodušení vytipování správných klonů se často používá systém modro-bílé selekce. Tento systém je založen na plazmidu, nesoucím LacZ gen, který propůjčuje buňce schopnost štěpit chromogenní substrát X-gal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside). Tímto dochází k modrému zabarvení kolonií. Uprostřed sekvence LacZ genu se nachází MCS (angl. multiple cloning site, tedy mnohočetné klonovací místo). Při vložení DNA fragmentu do MCS se sekvence LacZ genu přeruší, buňka již nemůže štěpit X-gal a vytváří bílou kolonii. Takovéto bílé kolonie jsou vybrány pro další práci.
Nedostatkem systému modro-bílé selekce je nutnost používat chromogenní substrát X-gal a látku-induktor IPTG. To vše zvyšuje cenu práce, navíc IPTG je toxická pro bakteriální buňky. Proto navrhujeme systém barevné detekce správných transformantů, který nemá uvedené nedostatky. Místo LacZ genu by byl použít gen vhb (Vitreoscilla hemoglobin). Z tohoto genu se exprimuje bakteriální hemoglobin, který přidává buňkám červeno-oranžovou barvu. Při přerušení sekvence vhb genu, stejně jako pří modro-bíle selekci, se vytváří bílé kolonie. Restrikční místa pro nejčastěji používané endonukleázy budou vytvořena pomocí tichých mutací, to znamená takových, při kterých dojde k substituci báze v tripletu, která nemění aminokyselinu v budoucím bílkovinném řetězci.
Cíle projektu jsou: vytvořit nízko a středně kopiové shuttle-vektory pro expresi a mutagenezi s barevným rozlišením transformantů, které jsou schopní replikace v Escherichia coli a Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.
Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group. Student bude absolvovat stáž v laboratoři po dobu 2 měsíců vcelku. Termín realizace srpen-září 2013.
Doporučená literatura:
- Suwanwong Y., Kvist M, Isarankura-Na-Ayudhya C., Tansila N., Bulow L., Prachayasittikul V. (2006) Chimeric antibody-binding Vitreoscilla hemoglobin (VHb) mediates redox-catalysis reaction: new insight into the functional role of VHb. Int. J. Biol. Sci., 2.
- Isarankura-Na-Ayudhya C., Panpumthong P., Tangkosaku T., Boonpangrak S., Prachayasittiku V. (2008) Shedding light on the role of Vitreoscilla hemoglobin on cellular catabolic regulation by proteomic analysis. Int. J. Biol. Sci. 4.
- Joshi M., Mande S., Dikshit K.L. (1998) Hemoglobin Biosynthesis in Vitreoscilla stercoraria DW: Cloning, Expression, and Characterization of a New Homolog of a Bacterial Globin Gene. Appl. Environ. Microbiol., 64(6): 2220-2228.
Představa o realizaci:
In silico silent mutagenesis.
PCR.
Elektroforéza v agarózovém gelu.
Elektroporace.
Restrikční štěpení.
Ligace.
Kultivace mikroorganismů na pevných a tekutých mediích.
Výstup: Závěrečná zpráva (doporučeno min. 10 stran), seznam použitých chemikálií a drobného laboratorního zařízení.
